Hur vet vi om ett virus finns – och var?
För att upptäcka virus i kroppen, i livsmedel eller i vårt avloppsvatten används ofta en teknik som kallas PCR. Det är en känslig metod som kan hitta även mycket små mängder virus – och som spelar en viktig roll både inom sjukvården och i samhällets smittövervakning.
På den här sidan kan du läsa mer om hur PCR fungerar, hur testningen går till i praktiken och hur virusövervakning via avloppsvatten kan ge tidiga varningar om smittspridning.
Vad är PCR?
PCR, eller polymeraskedjereaktion (från engelskans polymerase chain reaction), är en av de mest använda teknikerna inom modern molekylärbiologi och medicinsk diagnostik. Metoden utvecklades 1983 av den amerikanske biokemisten Kary Mullis, som senare belönades med Nobelpriset i kemi 1993. Med PCR kan mycket små mängder genetiskt material kopieras upp till miljontals identiska kopior. På så sätt går det att på ett snabbt och kostnadseffektivt sätt upptäcka även mycket små mängder av DNA i ett prov, exempelvis från ett virus. I dag används PCR i många sammanhang, bland annat inom medicinsk diagnostik, forskning, miljöövervakning och kontroll av livsmedel.
Så går det till:
PCR bygger på att kopiera specifika DNA molekyler med hjälp av två naturliga processer: DNA-hybridisering och DNA-replikation. För att metoden ska fungera måste man på förhand veta vilken DNA-sekvens man letar efter. Utifrån denna information designas testet så att det specifikt kopierar just det avsnittet av arvsmassan. Tack vare utvecklingen av moderna sekvenseringsmetoder känner vi idag till arvsmassan hos de flesta kända sjukdomsframkallande virus. Detta gör att forskare och sjukvårdspersonal snabbt kan ta fram PCR-tester som upptäcker just det virus man söker.
Många virus, som exempelvis coronavirus och norovirus, har RNA som arvsmassa istället för DNA. Eftersom PCR endast kan kopiera DNA måste RNA först omvandlas till DNA med hjälp av enzymet omvänt transkriptas. Denna vanliga variant kallas omvänd transkriptions-PCR (från engelskans reverse transcription PCR, RT‑PCR).
När man vill undersöka om ett virus finns i ett prov, till exempel från ett blod- eller avföringsprov hos en patient eller i ett livsmedel eller avloppsvatten, börjar man med att frigöra virusets genetiska material (DNA och/eller RNA) från viruspartiklarna som finns i provet. Detta renas och koncentreras innan analysen. För själva PCR-reaktionen räcker det ofta med så lite som några få mikroliter av det extraherade materialet.
I figurerna nedan visas i detalj hur PCRtekniken fungerar. Figur 1 illustrerar principen bakom DNAhybridisering och hur denna process utnyttjas i PCRmetoden och Figur 2 visar hur delar av den naturliga DNA-replikationsprocessen utnyttjas för att kopiera den valda DNAsekvensen. Själva PCR‑reaktionen sker i små provrör i en apparat som kallas termocykler. Denna maskin kan mycket snabbt växla mellan olika temperaturer, vilket är avgörande för att de olika stegen i processen ska fungera. En PCR-analys tar vanligtvis mellan en och fyra timmar, beroende på de specifika reaktionsförhållanden som används och längden på den DNA-sekvens som ska kopieras.
En viktig princip för PCR är att kopiering bara sker om den tänkta målsekvensen faktiskt finns i provet, om målsekvensen saknas sker ingen kopiering.
Figur 1: Principen för DNA-hybridisering och primerdesign.
PCR‑metoden går ut på att specifikt kopiera, eller amplifiera, en bestämd del av en DNA‑molekyl. Grunden för tekniken är den naturliga processen DNA‑hybridisering. En DNA‑molekyl består av två långa strängar som byggs utifrån så kallade kvävebaser. Det finns fyra olika baser: adenin (A), tymin (T), cytosin (C) och guanin (G). Varje bas i den ena strängen binder alltid till sin motsvarighet i den andra: A binder till T, och C binder till G. Som exempel binder DNA‑sekvensen ATGGC till sin komplementära sekvens TACCG. För att kunna kopiera just den del av DNA man är intresserad av designas två korta DNA‑stycken, så kallade primrar som fäster i målsekvensens ändar. En primer är vanligtvis 15-30 baser lång. Målregionen kan vara allt från omkring 50 till flera tusen baspar lång, beroende på vilken variant av PCR som används och vad analysen ska användas till. Figuren är anpassad och modifierad från Hartwell med kollegor.
Figur 2: Översikt över de olika stegen i PCR reaktionen
Olika typer av PCR
För att ta reda på om det sker någon kopiering av DNA‑molekyler i en PCR‑reaktion, det vill säga om målsekvensen finns i provet eller inte, måste de kopierade DNA-molekylerna kunna detekteras. Detta kan göras på olika sätt beroende på vilken variant av PCR‑metoden som används.
Traditionell PCR
Efter att PCR‑reaktionen är färdig analyseras resultaten i efterhand med hjälp av en metod som kallas gelelektrofores. Där separeras DNA‑fragmenten efter storlek och framträder som tydliga band på en gel. Denna metod är relativt långsam och ger framför allt ett kvalitativt svar, det vill säga om den specifika målsekvensen finns i provet eller inte.
Realtids-PCR
Denna metod är idag den mest använda tekniken inom exempelvis diagnostik. Här tillsätts fluorescerande ämnen som avger ljus i samma takt som DNA kopieras, vilket gör att hela reaktionen kan följas i realtid. På så sätt kan mål‑DNA detekteras under själva analysen, utan att man behöver analysera produkterna i efterhand med gelelektrofores. Realtids‑PCR är snabbare än traditionell PCR och har dessutom fördelen att den kan ge kvantitativ information, till exempel hur många kopior av virusets arvsmassa som fanns i ursprungsprovet.
Digital PCR
En ytterligare variant är digital PCR, där provet delas upp i tusentals mycket små reaktioner. På så sätt kan varje liten del antingen innehålla målsekvensen eller inte. Genom att räkna antalet positiva reaktioner och appliceras statistiska metoder (så kallas Poissonstatistik) går det att få en mer exakt kvantifiering av hur många kopior av målsekvensen som fanns i det ursprungliga provet. Digital PCR används främst i speciella situationer där hög kvantifieringsprecision är avgörande.
Tillämpningar inom virologiområdet
PCR används brett i många olika sammanhang, bland annat för att:
Diagnosticera virusinfektioner som vinterkräksjuka eller covid‑19.
Följa virusnivåer över tid hos patienter som får antiviral behandling för att säkerställa att behandlingen fungerar.
Övervaka virusnivåer i avloppsvatten, för att följa smittläget av exempelvis covid-19 eller influensavirus.
Kontrollera livsmedel och vatten för sjukdomsframkallande virus, vid exempelvis smittspårning efter sjukdomsutbrott.
Studera virus inom forskning.
Frågor och svar
om vaccin
Vad är egentligen ett virus? Vilka virussjukdomar har vi läkemedel mot? Och hur kan ett litet virus orsaka en stor pandemi?