PCR metodik  

Översikt 

Polymeraskedjereaktion, eller PCR (från engelskans polymerase chain reaction), är en av de mest använda teknikerna inom molekylärbiologi och medicinsk diagnostik. Metoden utvecklades 1983 av den amerikanske biokemisten Kary Mullis, som belönades med Nobelpriset i kemi 1993. PCR gör det möjligt att upptäcka låga koncentrationer av virus-DNA eller RNA i ett prov, genom att kopiera en specifik DNA-sekvens till miljontals identiska kopior. Tekniken används i allt från forskning och sjukvårdsdiagnostik till miljöövervakning och livsmedelskontroll. 

Grundprincip 

DNA består av två komplementära strängar som består av kvävebaser, där varje bas i den ena strängen binder till sin specifika motsvarighet i den andra strängen: adenin (A) med tymin (T), och cytosin (C) med guanin (G). Denna struktur möjliggör exakt kopiering av genetisk information. PCR-tekniken efterliknar cellens naturliga DNA-replikation, men sker i provrör med hjälp av enzymet DNA-polymeras, som bygger en ny DNA-sträng med en befintlig sträng som mall. 

Så går det till  

Provberedning  

När ett prov tas för att undersöka förekomst av ett virus, från exempelvis en patient, ett livsmedel eller avloppsvatten, inleds processen med att det genetiska materialet (DNA och/eller RNA) extraheras. Denna extraktion skiljer nukleinsyrorna från annat material och koncentrerar dem. Ofta räcker det med 1 till 5 mikroliter extraherat prov för att kunna genomföra en PCR-analys. 

Design av PCR-metoder  

För att PCR ska fungera måste man på förhand veta vilken genetisk målsekvens man letar efter. Två korta enkelsträngade DNA-fragment, så kallade primrar, används för att binda till början och slutet av den målsekvens man är intresserad av. Dessa primrar är cirka 20 DNA-baser långa och är designade för att enbart binda till den önskade målsekvensen och inte till andra DNA-sekvenser som kan finnas i provet.  

För att designa primrar för analys av ett visst virus letar man i genetiska databaser efter korta sekvenser som är gemensamma för alla varianter av viruset men som inte förekommer hos andra organismer. Den del av genomet som amplifieras, det vill säga kopieras, i PCR kan vara allt från cirka 50 till flera tusen baspar lång, beroende på vilken typ av PCR som används och vad analysen syftar till.  

PCR-reaktionen 

En typisk PCR-reaktion innehåller: 

• Extraherat DNA från ursprungsprovet 

• Två specifika primrar (en framåt och en bakåt) 

• Ett värmetåligt DNA-polymeras 

• Kvävebaser (A, T, C och G), som DNA-polymeraset använder för att syntetisera nytt DNA 

• En buffertlösning som skapar rätt kemiska förutsättningar för reaktionen 

Reaktionen sker i en termocykler, en maskin som snabbt växlar mellan tre temperatursteg: 

• Denaturering (94–96 °C): DNA-strängarna separeras från en dubbelsträng till två enkelsträngar. 

• Annealing (50–65 °C): Primrarna binder till de enkelsträngade målsekvenserna, om de finns i provet. 

• Extension (55–72 °C): DNA-polymeraset bygger nya DNA-strängar av de primerbundna målsekvenserna.  

Denna cykel upprepas 25 till 50 gånger, vilket leder till en exponentiell ökning av målsekvensen. Om målsekvensen saknas sker ingen amplifiering. En PCR-analys tar vanligtvis mellan en och fyra timmar, beroende på de specifika reaktionsförhållanden som används och längden på den DNA-sekvens som ska amplifieras.  

Detektion och kvantifiering  

För att detektera amplifierat DNA kan olika metoder användas. I så kallad konventionell PCR visualiseras PCR-produkterna  i efterhand med hjälp av gelelektrofores, där de amplifierade målfragmenten separeras och visualiseras som band på en gel. Denna metod ger dock i huvudsak kvalitativ information (om målsekvensen finns eller inte finns i ursprungsprovet) och är mer tidskrävande än moderna alternativ. 

I realtids-PCR, som är vanligast inom diagnostiken idag, används fluorescerande ämnen som avger ljus i takt med att målsekvensen amplifieras. Denna metod är snabbare och känsligare än konventionell PCR, och kan också ge kvantitativ information, exempelvis genom att visa antalet viruskopior per milliliter i ett blodprov.  

Andra varianter, såsom digital PCR, finns också. Denna metod delar upp PCR-reaktionen i tusentals små reaktioner, vilket möjliggör en mer exakt kvantifiering av målsekvensen. 

Analys av RNA-virus 

Många virus, som SARS-CoV-2 och norovirus, har RNA som sitt genetiska material istället för DNA. Eftersom PCR endast fungerar på DNA, måste RNA först omvandlas till DNA med hjälp av enzymet omvänt transkriptas, innan PCR kan köras på vanligt sätt. Denna metod kallas RT-PCR (reverse transcription PCR). 

Exempel på tillämpningsområden inom virologi  

PCR används brett inom forskning, virusdiagnostik och övervakning. Exempel på vanliga tillämpningar är: 

• Diagnos av virusinfektioner, till exempel vinterkräksjuka eller covid-19 

• Uppföljning av virushalter vid antiviral behandling 

• Övervakning av virusnivåer i avloppsvatten 

• Kontroll av livsmedel och vatten för att påvisa sjukdomsframkallande virus 

• Forskning om virus och deras genetiska egenskaper 

• Förberedelse för sekvensering genom att kopiera upp virusets genom 

Fördelar och begränsningar  

PCR är en flexibel metod som mycket snabbt kan anpassas till nya virus så snart deras genetiska sekvens är känd. Metoden har en hög känslighet och kan upptäcka mycket små mängder virus. Metoden har även en hög specificitet och kan därför ofta designas för att skilja mellan olika varianter inom samma virusart. 

Samtidigt finns vissa begränsningar. Exempelvis kan PCR enbart visa om genetiskt material finns i provet, inte om viruset är aktivt eller smittsamt. Ett positivt PCR resultat från exempelvis ett livsmedelsprov innebär alltså inte nödvändigtvis att det finns en faktisk risk för smitta. 

En annan begränsning är att PCR kräver att man på förhand måste veta vilken sekvens, exempelvis vilket virus, man söker efter. Tekniken kan alltså till exempel inte användas för att upptäcka och identifiera nya virus.